1 主題內容與適用范圍

　　本標準規定了飼料中維生素B₁的測定方法。

　　本標準適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、維生素預混料中維生素B₁的測定。萃取液的濃度范圍為0.02～0.2μg/mL（在有吸附硫胺素或影響硫色素熒光干擾物質的情況下，本標準不適用）。

　　2 引用標準

　　GB 6682 實驗室用水規格

　　3 方法原理

　　試樣中的維生素B₁（即硫胺素C₁₂H₁₇ON₄SCl）經稀酸消化、酶分解、吸附劑的吸附分離提純后，在堿性條件下被鐵氰化鉀氧化生成熒光色素——硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的熒光強度與試樣中維生素B₁的含量成正比，依此進行定量測定。

　　4 試劑和溶液

　　除特殊規定外，本標準所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或相應純度的水。

　　4.1 鹽酸溶液，0.1mol/L：將8.5mL鹽酸（GB 622）用水稀釋至1000mL。

　　4.2 硫酸溶液，0.05mol/L：將2.8mL濃硫酸（GB 625）加入水中，稀釋至1000mL。

　　4.3 乙酸鈉溶液，2.0mol/L：取164g無水乙酸鈉（GB 694）或272g結晶乙酸鈉（CH₂COONa·3H₂O GB 693）溶于水，稀釋至1000mL。

　　4.4 淀粉酶懸浮液，100g/L：用2.0mol/L乙酸鈉溶液（4.3）懸浮10g淀粉酶制劑（Takadiastase，或相當活性的其他磷酸酯酶），稀釋至100mL，使用當日制備。

　　4.5 氯化鉀（GB 646）溶液，250g/L。

　　4.6 酸性氯化鉀溶液：將8.5mL濃鹽酸加入至氯化鉀溶液（4.5）中，慚稀釋至1000mL。

　　4.7 氫氧化鈉（GB 629）溶液，150g/L。

　　4.8 鐵氰化鉀（GB 644）溶液，10g/L。

　　4.9 堿性鐵氰化鉀溶液：4.0mL的鐵氰化鉀溶液（4.8）與氫氧化鈉溶液（4.7）混合使之成100mL，此液4h內使用。

　　4.10 冰乙酸（GB 676）溶液，30mL/L。

　　4.11 人造沸石（Q/HG 12-445-63，60～80目）使用前必需活化，方法如下：

　　將適量人造沸石置于大燒杯中，加入10倍容積的熱乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均勻攪動10min，使沸石在乙酸溶液中懸浮，待沸石沉降后，棄去上層乙酸液。重復上述操作兩次。換用5倍其容積的熱氯化鉀溶液（4.5）攪動清洗兩次，每次15min。再用熱乙酸溶液洗10min。最后用熱蒸餾水清洗沸石至無氯離子（用10g/L硝酸銀水溶液檢驗）。用布氏漏斗抽濾，100℃烘干，貯于磨口瓶中備用。使用前，檢查沸石對硫胺素標準溶液的回收率，如達不到92%，需重新活化沸石。

　　4.12 硫胺素標準溶液

　　4.12.1 硫胺素貯備液Ⅰ：鹽酸硫胺素純品（中國藥典參照標準），于五氧化二磷干燥器24h，稱取0.0500g，溶解于ph4.5～4.3的20%（V/V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升含0.1mg硫胺素。

　　4.12.2 硫胺素貯備液Ⅱ：取硫胺素貯備液Ⅰ（4.12.1）10mL用酸性20%乙醇溶液定容至100mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升中含10μg硫胺素。

　　4.12.3 硫胺素標準工作液：取貯備液Ⅱ（4.12.2）2mL與65mL鹽酸溶液（4.1）和5mL乙酸鈉溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。現用現配。該溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。

　　4.13 硫酸奎寧（Q/HG 22-797-68）溶液

　　4.13.1 硫酸奎寧貯備液：稱取硫酸奎寧0.1000g，用0.05mol/L硫酸（4.2）溶解并定容至1000mL，貯于棕色瓶中低溫保存。若溶液混濁則需重新配制。該溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎寧。

　　4.13.2 硫酸奎寧工作液：取貯備液（4.13.1）3mL，用0.05mol/L硫酸定容至 1000mL，盛于棕色瓶中，低溫保存。該溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎寧。

　　4.14 正丁醇（HG 3-1012），其熒光強度不超過硫酸奎寧工作液的4%，否則需用全玻璃蒸餾器重蒸餾，取114℃～118℃餾份。

　　4.15 無水硫酸鈉（HG 3-123）。

　　5 儀器、設備

　　5.1 熒光分光光度計，備1cm石英比色杯。

　　5.2 電熱恒溫水浴。

　　5.3 電熱恒溫箱。

　　5.4 實驗室用樣品粉碎機。

　　5.5 分析天平：感量0.0001g。

　　5.6 注射器：10mL。

　　5.7 吸附分離柱：全長235mm，外徑×長度如下：

　　上端貯液槽容量約為50mL，35mm×70mm；中部吸附管8mm×130mm；下端35mm；下端35mm拉成毛細管。

　　5.8 反應瓶：具塞離心管25mL。

　　6 試樣的制備

　　選取有代表性的飼料樣品，至少500g，四分法縮減至100g，磨碎，過0.28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存備用。

　　7 分析步驟

　　7.1 稱樣：稱取單一飼料、配合飼料或濃縮飼料1～2g（約含硫胺素4～20μg），精確至0.001g。維生素預混料0.25～0.5g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中。

　　7.2 提取

　　7.2.1 水解：將0.1mol/L鹽酸（4.1）65mL加入試樣瓶（7.1）中，經沸水浴加熱30min，開始加熱5～10min內不時搖動容量瓶，以防結塊。或于121℃～123℃15磅高壓釜中加熱30min。

　　7.2.2 酶解：冷卻容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶懸浮液（4.4），搖勻。該試液的pH約為4.0～4.5，將容量瓶于45℃～50℃恒溫箱中保溫3h，取出冷卻調整pH4.5，用水稀釋至100mL。

　　7.2.3 過濾：將試液通過無灰濾紙過濾棄去初濾液5mL，收集濾液于錐形瓶中。預混料提取液需逐級稀釋，使之含硫胺素約為0.2μg/mL。

　　7.3 提純

　　7.3.1 制備吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小燒杯中，加入3%乙酸溶液（4.10）浸泡。將脫脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒輕壓。然后將乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脫水），過柱流速≤1mL/min為宜。再用10mL近沸的洗柱一次。

　　7.3.2 吸25mL提取液（7.2.3），慢慢加入制備好的吸附柱中，棄去濾液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，棄去洗液。

　　7.3.3 用25mL 60℃～70℃酸性氯化鉀（4.6）分三次連續加入吸附柱，收集洗脫液于25mL容量瓶中，冷卻后用酸性氯化鉀定容，混勻。

　　7.3.4 同時用25mL硫胺素標準工作液（4.12.3）。重復7.3.1～7.3.3操作，作為外標。

　　7.4 氧化與萃取（以下操作避免紫外光照射）

　　7.4.1 于兩只反應管中各吸入5mL洗脫液（7.3.3），記作A、B。

　　7.4.2 向B管加3mL氫氧化鈉溶液（4.7），再向A管中加3mL氧化劑堿性鐵氰化鉀溶液（4.9），輕輕旋搖。依次立即向A管加15mL正丁醇加塞，劇烈地振搖15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共同振搖90s，靜置分層。

　　7.4.3 用注射器吸去下層水相，向各反應管加入約2g無水硫酸鈉（4.15），旋搖，待測。

　　7.4.4 同時將5mL作為外標的洗脫液（7.3.4），置入另兩只反應管，相應地記作C、D，按7.4.1～7.4.3操作。

　　7.5 測定

　　7.5.1 用硫酸奎寧工作液（4.13.2）調整熒光儀，使其穩定于一定數值，作為儀器工作的固定條件。

　　7.5.2 于激發波長365nm，發射波長435nm處測定各反應管中萃取液［（7.4.3）和（7.4.4）］的熒光強度。

　　8 分析結果的計算和表述

　　8.1 計算公式

　　硫胺素（維生素B₁）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式計算：

　　硫胺素（VB₁mg/kg）＝〔（T－T₀）/（S－S₀）〕×C×（V₂/V₁）×（V₀/m）

　　式中：T──A管試液的熒光強度；T₀──B管試液空白的熒光強度；S──C管標準溶液的熒光強度；S₀──D管標準溶液空白的熒光強度；C──硫胺素標準工作液濃度，μg/mL；0──提取液總體積，mL；V₁──分取提取液過柱的體積，mL；V₂──酸性氯化鉀洗脫液體積，mL；m──試樣質量，g。

　　8.2 平行測定結果用算術平均值表示，保留有效數3位。

　　9 重復性

　　同一分析者對同一試樣同時或快速連續進行兩次測定，所得結果之間的差值；在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg時，不得超過平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg時，不得超過平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg時不得超過平均值的5%。